Elektroforesis, Teknik Menganalisis Pergerakan Molekul

Sebelumnya udah pernah belum mendengarkan kata elektroforesis. Mungkin sebagian orang sudah pernah mendengar kalimat tersebut. Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. DNA yang akan dianalisis dengan elektroforesis biasanya dipotong menjadi potongan-potongan kecil menggunakan enzim restriksi.

DNA dan RNA relatif sederhana dalam hal struktur dan komposisi. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Untuk penjelasan lebih dalam lagi silahkan ikuti artikel berikut ini.

Apa Itu Elektroforesis?

Elektroforesis merupakan teknik pemisahan komponen atau molekul yang memiliki perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul bergerak tergantung pada muatan, bentuk dan juga ukuran pada medan listrik. Posisi molekul akan di deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi yang terseparasu pada gel atau dilakukan kantifikasi dengan densitometer. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.

Elektroforesis asam deoksiribonukleat (DNA) digunakan untuk memetakan urutan fragmen restriksi dalam kromosom, mengenalisis DNA dalam suatu populasi dengan membatasi polimorfisme panjang fragmen dan juga untuk menentukan urutan nukleotida sepotong DNA. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif.

Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatan maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Pada elektroforesis gel, molekul yang ingin dipisahkan oleh medan elektrik melalui sebuah gel yang berpori kecil. Molekul akan berjalan melalui pori dalam gel pada kecepatan yang berbanding terbalik dengan panjangnya.

Yang dimaksud disini adalah molekul DNA yang lebih kecil akan melalui jarak yang lebih jauh melalui gel dari pada molekul DNA yang lebih besar. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pada bentuk molekulnya. Pergerakan molekul tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawaan oleh variasi group ionogenik.

pH dari medium dalam mengkateristik tergantung pada kekuatan molekul listrik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai. Dalam elektroforesis gel, molekul yang lebih besar bermigrasi lebih lambat daripada yang lebih kecil, sehingga jarak migrasi dalam gel dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul.

Prinsip

Prinsip elektroforesis digunakan untuk memisahkan pertikel dalam satu campuran. Contohnya, memisahkan partikel debu pada asap suatu industri dengan alat cottrell. Partikel koloid yang berupa debu akan ditarik ke salah satu elektrode sehingga terpisah dari mediumnya yang disebut dengan gas buangan. Ini yang menyebabkan gas terbuang di udara menjadi bersih dari partikel-partikel debu.

Akhirnya, setelah molekul DNA, RNA, atau protein terpisah menggunakan elektroforesis gel, pita (band) yang menunjukkan ukuran berbeda tiap molekul dapat dideteksi.

Jenis Elektroforesis

Ada beberapa jenis elektroforesis yang terdiri dari:

  • Elektroforesis Kertas

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.

Teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan di awal biokimia yang diteliti pada tahun 1950 menggunakan molekular DNA?RNA hidrolisis. Hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara intermediate (pospat siklik). Kemudian dipublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme dengan menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis yaitu nukleotida “siklik”.

Hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Ini dinamakan dengan elektroforesis yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, juga tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis di taruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.

  • Elektroforesis Gel

Ini merupakan elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Elektroforesis gel awalnya dilakukan dengan medium gel kanji (fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Setelah itu elektroforesis gel berkembang menjado agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. Untuk proses penyempurnaan dilakukan hingga 12 tahun.

Setelah itu baru bisa ditemukan gel poliakrilamida (PAGE : Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.

Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai genom.

  • Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)

ulse-field Gradient Gel Electrophoresis (PFGE) merupakan DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA akan bercampur dengan kontamin yang tidak diinginkan.

Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang yaitu sebagai berikut:

  1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan untuk memeriksa DNA. Hal ini dapat membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.
  2. Dalam kegiatan biologi molekur, elektroforesis adalah salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaa DNA, plasmid dan produk PCR
  3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

Sifat Elektroforesis Koloid

Elektroforesis koloid selain fungsinya untuk menentukan muatan suatu partikel koloid, juga bermanfaat dalam bidang industri. Penggunaan dan pemanfaatan sifat elektroforesis koloid dalam industri yaitu sebagai proses pembuatan sarung tangan karet dan untuk mengurangi pencemaran udara dengan metode Cottrel. Didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil berpengaruh pada medan listrik.

Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Sedangkan untuk elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100pb dan dijalankan secara horizontal. Sedangkan poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Gel agarosa dapat melakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb).

Molekul DNA yang bermuatan negatif yang ada di medan listrik akan berimigrasi melalui matriks gel menuju kutub poditif (anode). Semakin besar ukuran molekulnya, maka semakin rendah laju migrasinya. Elektroforesis asam ribonukleat adalah prosedur integral dalam banyak penelitian ekspresi gel.

RNA diisolasi atau dipisahkan oleh elektroforesis. Kemudian fragmen RNA yang dipisahkan gel dipindahkan ke membran nilon menggunakan teknil yang disebut Nothern blot. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya.

Banyak molekul biologis seperti asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam-asam nukleat memiliki gugus yang dapat engion sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+) atau anion (-). Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi muatan. RNA dan DNA relatif sederhana dalam hal struktur dan komposisi.

Protein terdiri dari dua puluh asam amino yang berbeda dalam berbagai kombinasi. Selain itu, protein juga berbeda secara signifikan dalam struktur tiga dimensi mereka. Komposisi asam amino akan mempengaruhi muatan pada protein yang pada akhirnya akan mempengaruhi perilaku elektroforesisnya.

Bentuk protein yang sama juga akan mempengaruhi laju migrasi. Hal ini akan mengakibatkan teknik khusus elektroforesis gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) dapat menganalisis protein. Dalam metode ini, sampel protein dipanaskan dan kemudian diperlakukan dengan deterjen natrium dodesil sulfat (SDS).

Itulah penjelasan mengenai Elektroforesis. Dimana Elektroforosis digunakan untuk memetakan urutan fragmen restriksi dalam kromosom, untuk menganalisis variasi DNA dalam suatu populasi dengan membatasi polimorfisme panjang fragmen dan untuk menentukan urutan nukleotida sepotong DNA.

Author: Virgil Howell

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *